2.5. МЕЖВИДОВОЙ ПЕРЕНОС ВОДОРОДА И СИНТРОФИЯ

Помимо прямого окисления ЛЖК вторичными анаэробами, существует иной термодинамически возможный процесс разложения этих соединений, обусловленный бинарным взаимодействием между группами микроорганизмов.

Принципиальным открытием в этой области было открытие М. Брианом и Е. Волиным (М. Bryant, E. Wolin) в 1970-х гг. катаболической синтрофии, под которой подразумевалось осуществление реакции катаболизма только в случае взаимодействия двух организмов. На самом деле это понятие имеет гораздо более широкое значение и не позволяет ставить знак равенства между чистой культурой и возможностями микроорганизмов в сообществе. Явление катаболической синтрофии означает, что сообщество микроорганизмов можно и следует рассматривать как биологическое единство, обусловленное термодинамическими возможностями совокупности его компонентов.

Наиболее ясно дело обстоит с водородом. История такова. В 1936 г. Г. Баркер (Н. Barker), работая в Дельфте, описал под названием "Methanobacillus omelianskii" споровый организм, который образовывал метан из этанола. Потом в Калифорнии ученица Баркера Т. Штадтман (Т. Stadtman) описала еще ряд культур метаногенов, которые превращали в метан органические кислоты (бутират, пропионат). Таким образом, была, казалось бы, решена задача описания биологического процесса метанового сбраживания органических кислот, который с очевидностью наблюдался на практике при метаногенезе. В 1970-х гг. с развитием строго анаэробной техники было подтверждено утверждение Н. Зёнгена (N. Sohngen), что большинство метанобразующих бактерий использует водород и есть только два организма, способных использовать ацетат, Methanosarcina и Methanothrix (Methanosaeta). Волин и Бриан доказали, что на самом деле культура "Methanobacillus omelianskii" содержит два организма: один ("форма S"), споровый, близкий к Clostridium kluyveri, разлагающий этанол с образованием ацетата и выделением Н2, и второй (штамм "М.о.Н."), превращающий Н2 в инертный метан. Реакция выделения Н2 из этанола термодинамически невыгодна-и становится

210

возможной лишь при глубоком удалении Н2 из сферы реакции. В результате суммарная реакция термодинамически возможна и способна обеспечить оба организма необходимой энергией. Реакция была названа межвидовым переносом водорода.

За этой работой последовала целая серия других и был разобран ряд реакций с бинарными культурами. Организмы, способные к развитию при условии, что Н2 удаляется из сферы реакции, получили название синтрофов и составили особую функциональную группу в сообществе. Из несбраживаемых соединений они образуют ацетат и водород. Синтрофы развиваются совместно с Н2-использующими анаэробными организмами. Среди Н2-использующих бактерий важны две группы: литотрофные метаногены и литотрофные сульфидогены. Был описан целый ряд культур, в которых анаэробное окисление субстрата обусловлено присутствием Н2-использующего компонента.

Развитие синтрофов обусловлено выигрышем свободной энергии за счет уменьшения концентрации продукта. Для реакции

A + B = C + D

даже при недостаточном или же положительном значении свободной энергии в стандартных условиях возможен выигрыш, если концентрация продуктов мала, и значение концентрационного члена ln перекрывает недостаток энергии в соответствии с уравнением:

ΔG' = ΔGo' + RT ln 

Поскольку окислительно-восстановительная реакция может быть представлена как реакция дегидрогенизации, то ключевой оказывается реакция удаления Н2. Снижение концентрации Н2 может осуществляться любым способом, например: продувкой газом, реакцией с окислителем (например, с серой, как было показано Е.А. Бонч-Осмоловской для "серозависимых" архебактерий Desulfurococcus), но наиболее важным способом удаления служит использование Н2 гидрогенотрофами. В этом случае

211

процесс принципиально может осуществляться только в присутствии двух организмов: одного, обладающего "выделяющей гид-рогеназой", и другого, с "поглощающей гидрогеназой", хотя функции фермента зависят от сопряжения с системой реакций внутри организма. Для сообществ, как и для клеток бактерий, принцип "единства в биохимии" (Einheit in der Biochemie) А. Клюйвера (A. Kluyver) сводится к окислительно-восстановительным реакциям с переносом водорода, но не дегидрогеназами, а в виде Н2. Термодинамика межвидового переноса водорода была разобрана для разложения летучих жирных кислот в метаногенном сообществе Б. Шинком и М. Фридрихом (В. Schink, M. Friedrich, 1994). Рассмотрим окисление бутирата в метаногенном сообществе:

СН3СН2СН2СОО- + 2Н+ + 2Н2О = 5СН4 + ЗСО2
ΔG0' - 177 кДж на 2 моля

В метантенке концентрация бутирата составляет 10 мкМ, метана - 0,7 бар, углекислоты - 0,3 бар и выход реакции снижается до -145 кДж, на которые надо прокормить три организма: один, разлагающий бутират на ацетат и водород, второй, окисляющий водород, и третий, ацетокластичеекий. Проходит семь реакций: для бутирата две, для водородного метаногена одна, для ацетокластического метаногена четыре. Для получения трех минимальных выходов анергии по 21 кДж концентрация ацетата должна быть 50 мкМ, а водорода - 104,7 бар. Нижний термодинамический предел для водорода в реакции метаногенеза составляет 105,7 бар.

Свободная энергия реакции и окислительно-восстановительный потенциал для наиболее важных реакций приведены ниже.

  ΔG',кДж n E', мВ
СН3СН2СН2СОО- + 2Н2О = 2СН3СОО- + Н++2Н2 +48,3 2 -125,-250
СН3СН2СОО- + 2Н2О = СН3СОО- + СО2 + ЗН2 +76,0 3 +30,-176,-470
СН3СН2ОН + Н2О = СН3СОО- + H+ + 2Н2 9,6 2 -190, -375
СН2ОНСОО- + Н+ + Н2О = 2СО2 + ЗН2 +19,3 3 -92,-331,-470

212

Окисление бутирата осуществляет Syntrophomonas wolfei. Гидрогеназа у этого организма расположена в периплазматичес-ком пространстве и ингибируется 2-8 мМ хлористой меди, которая воздействет только на периплазматический фермент. Для активации окисления ЛЖК за счет АТФ организмы вынуждены использовать обратный транспорт. Аналогично идет окисление пропионата у Syntrophobacter wolinii. Получая очень мало энергии, синтрофы растут медленно, и общая скорость осуществляемого ими процесса зависит от накопленной биомассы. Поэтому в сообществах наблюдается временное накопление ЛЖК. Синтрофные отношения не обязательно обусловлены деятельностью синтрофов "в строгом смысле-, их функции могут выполнять и другие организмы.

При работе с анаэробными культурами, разлагающими малодоступные вещества, синтрофные отношения наблюдаются очень часто. Соответственно нередки и ошибки при описании "чистых культур", которые при проверке оказывались устойчивыми кооперативными комбинациями.

Для термодинамического разрешения роста за счет удаления Н2 из сферы реакции важен тот нижний предел концентрации, до которого тот или иной организм способен удалять Н2. Довольно быстро было установлено, что сульфатвосстанавливающие бактерии в этом отношении эффективнее метаногенов. Но для не зависящего от внешних акцепторов сообщества важны метаногены.. Специальные исследования были проведены с чистыми культура-, ми метаногенов на основе использования высокочувствительного твердоэлектролитного детектора Н2 в Институте микробиологии РАН. Н2 измеряли в газовой фазе, которая предположительно находится в равновесии с жидкой (по закону Генри концентрация растворенного газа находится в равновесии с газовой фазой пропорционально парциальному давлению). Оказалось, что водородные метаногены имеют определенные пороги, до которых они могут снижать содержание Н2. Для мезофильных штаммов Ме-thanobacterium эта величина была около 5 р. р. т., а для Metha-nosarcina - около 50 р. р. т. Для термофильных штаммов Ме-thanobacterium пороговая величина была существенно выше, чем для мезофильных, и составляла 20-30 р. р. т. Психрофильных

213

водородных метаногенов пока в культурах нет. Существенно, что для метаногенного сообщества навоза - а оно представляет богатейший набор разных видов - пороговые концентрации точно соответствовали пороговым значениям для чистых культур водородных метаногенов. Повышение концентрации Н2 было первым сигналом разбалансированности в работе сообщества вследствие какого-либо стресса. Впоследствии аналогичные работы были проведены и в других лабораториях. Определение нижнего порога концентрации Н2 стало стандартным приемом и осуществляется очень просто - определяют конечную концентрацию Н2 в поздней стационарной фазе роста культуры.

Как известно, выделение и потребление Н2 осуществляется гидрогеназами, катализирующими обратимую реакцию:

Н2 = 2Н+ + 2е-

Следовательно, можно предположить, что устанавливаются некоторые равновесные концентрации Н2. Впервые такая равновесная концентрация была установлена Т. Н. Жилиной при разложении метанола Methanosarcina. При выделении чистой культуры метаногена упорным спутником ее оказался Desulfovibrio vulgaris, не использующий метанол, как и другие сульфатредукторы, но растущий с Н2. Выяснилось, что метилотрофные мета-ногены при росте на метиламинах поддерживают стационарную концентрацию Н2 за счет его выделения. Таким образом, в бинарной культуре Methanosarcina + Desulfovibrio метаноген выполнял роль синтрофа по отношению к сульфидогену, имеющему большее сродство к Н2.

Синтрофные отношения исследуются в основном с помощью бинарных культур. Как правило, задача решается путем анализа с выделением чистых культур, за которым следует ресинтез - подтверждение реакции в комбинации двух чистых культур. Обычно комбинированные культуры дают только качественный ответ, количественное соответствие первоначальной накопительной культуре удается редко.

Сейчас известен ряд пороговых значений для разных групп вторичных Н2-использующих литотрофных организмов. Они располагаются в следующем порядке:

214

Гомоацетатные около 1000 р. р. т. Н2 (газ)
Метанобразующие 100 - 10
Сульфатвосстанавливающие 10-1
Железовосстанавливающие 1-0,1
Аэробные водородные < 0,1

Межвидовой перенос водорода подвел черту под эпохой исключительного господства чистых культур в бактериологии, юридически закрепленного Бактериологическим кодексом, по которому узаконивались только "чистые культуры в международно-признанных коллекциях". Этот перелом проходил в 1980-х гг. и до сих пор еще не вполне осознан представителями физиолого-биохимического направления и клеточной биологии. Для природоведческого направления общей микробиологии, наряду с чистой культурой, объектом исследования стало микробное сообщество.

Термодинамический выигрыш при удалении продукта реакции может быть получен не только для Н2, но и для других соединений. Из них особенное внимание привлек формиат, который обладает высокой растворимостью и не переходит в газовую фазу. Формиат образуется в ряде смешанных брожений, особенно у энтеробактерий и клостридий. Он легко разлагается формиатлиазой по реакции:

НСООН = СO2 + Н2.

Методы определения формиата менее чувствительны и удобны, чем для Н2, и отчасти поэтому ясности здесь нет. Мнение, что формиат может быть объектом межвидового переноса, сомнению не подвергается, но значение этого процесса в природе оспаривается. Катаболическая синтрофия с межвидовым переносом водорода представляет один из ключевых процессов в анаэробном сообществе. Таким образом, водородный путь с участием гидрогенотрофных вторичных анаэробов в сочетании с явлением синтрофии оказывается принципиальным для сообщества в целом.

215

Rambler's Top100
Lib4all.Ru © 2010.