2.5. МЕЖВИДОВОЙ ПЕРЕНОС ВОДОРОДА И СИНТРОФИЯ

Помимо прямого окисления ЛЖК вторичными анаэробами, существует иной термодинамически возможный процесс разложения этих соединений, обусловленный бинарным взаимодействием между группами микроорганизмов.

Принципиальным открытием в этой области было открытие М. Брианом и Е. Волиным (М. Bryant, E. Wolin) в 1970-х гг. катаболической синтрофии, под которой подразумевалось осуществление реакции катаболизма только в случае взаимодействия двух организмов. На самом деле это понятие имеет гораздо более широкое значение и не позволяет ставить знак равенства между чистой культурой и возможностями микроорганизмов в сообществе. Явление катаболической синтрофии означает, что сообщество микроорганизмов можно и следует рассматривать как биологическое единство, обусловленное термодинамическими возможностями совокупности его компонентов.

Наиболее ясно дело обстоит с водородом. История такова. В 1936 г. Г. Баркер (Н. Barker), работая в Дельфте, описал под названием "Methanobacillus omelianskii" споровый организм, который образовывал метан из этанола. Потом в Калифорнии ученица Баркера Т. Штадтман (Т. Stadtman) описала еще ряд культур метаногенов, которые превращали в метан органические кислоты (бутират, пропионат). Таким образом, была, казалось бы, решена задача описания биологического процесса метанового сбраживания органических кислот, который с очевидностью наблюдался на практике при метаногенезе. В 1970-х гг. с развитием строго анаэробной техники было подтверждено утверждение Н. Зёнгена (N. Sohngen), что большинство метанобразующих бактерий использует водород и есть только два организма, способных использовать ацетат, Methanosarcina и Methanothrix (Methanosaeta). Волин и Бриан доказали, что на самом деле культура "Methanobacillus omelianskii" содержит два организма: один ("форма S"), споровый, близкий к Clostridium kluyveri, разлагающий этанол с образованием ацетата и выделением Н₂, и второй (штамм "М.о.Н."), превращающий Н₂ в инертный метан. Реакция выделения Н₂ из этанола термодинамически невыгодна-и становится

210

возможной лишь при глубоком удалении Н₂ из сферы реакции. В результате суммарная реакция термодинамически возможна и способна обеспечить оба организма необходимой энергией. Реакция была названа межвидовым переносом водорода.

За этой работой последовала целая серия других и был разобран ряд реакций с бинарными культурами. Организмы, способные к развитию при условии, что Н₂ удаляется из сферы реакции, получили название синтрофов и составили особую функциональную группу в сообществе. Из несбраживаемых соединений они образуют ацетат и водород. Синтрофы развиваются совместно с Н₂-использующими анаэробными организмами. Среди Н₂-использующих бактерий важны две группы: литотрофные метаногены и литотрофные сульфидогены. Был описан целый ряд культур, в которых анаэробное окисление субстрата обусловлено присутствием Н₂-использующего компонента.

Развитие синтрофов обусловлено выигрышем свободной энергии за счет уменьшения концентрации продукта. Для реакции

даже при недостаточном или же положительном значении свободной энергии в стандартных условиях возможен выигрыш, если концентрация продуктов мала, и значение концентрационного члена ln перекрывает недостаток энергии в соответствии с уравнением:

Поскольку окислительно-восстановительная реакция может быть представлена как реакция дегидрогенизации, то ключевой оказывается реакция удаления Н₂. Снижение концентрации Н₂ может осуществляться любым способом, например: продувкой газом, реакцией с окислителем (например, с серой, как было показано Е.А. Бонч-Осмоловской для "серозависимых" архебактерий Desulfurococcus), но наиболее важным способом удаления служит использование Н₂ гидрогенотрофами. В этом случае

211

процесс принципиально может осуществляться только в присутствии двух организмов: одного, обладающего "выделяющей гид-рогеназой", и другого, с "поглощающей гидрогеназой", хотя функции фермента зависят от сопряжения с системой реакций внутри организма. Для сообществ, как и для клеток бактерий, принцип "единства в биохимии" (Einheit in der Biochemie) А. Клюйвера (A. Kluyver) сводится к окислительно-восстановительным реакциям с переносом водорода, но не дегидрогеназами, а в виде Н₂. Термодинамика межвидового переноса водорода была разобрана для разложения летучих жирных кислот в метаногенном сообществе Б. Шинком и М. Фридрихом (В. Schink, M. Friedrich, 1994). Рассмотрим окисление бутирата в метаногенном сообществе:

В метантенке концентрация бутирата составляет 10 мкМ, метана - 0,7 бар, углекислоты - 0,3 бар и выход реакции снижается до -145 кДж, на которые надо прокормить три организма: один, разлагающий бутират на ацетат и водород, второй, окисляющий водород, и третий, ацетокластичеекий. Проходит семь реакций: для бутирата две, для водородного метаногена одна, для ацетокластического метаногена четыре. Для получения трех минимальных выходов анергии по 21 кДж концентрация ацетата должна быть 50 мкМ, а водорода - 10^4,7 бар. Нижний термодинамический предел для водорода в реакции метаногенеза составляет 10^5,7 бар.

Свободная энергия реакции и окислительно-восстановительный потенциал для наиболее важных реакций приведены ниже.

	ΔG',кДж	n	E', мВ
СН3СН2СН2СОО- + 2Н2О = 2СН3СОО- + Н++2Н2	+48,3	2	-125,-250
СН3СН2СОО- + 2Н2О = СН3СОО- + СО2 + ЗН2	+76,0	3	+30,-176,-470
СН3СН2ОН + Н2О = СН3СОО- + H+ + 2Н2	9,6	2	-190, -375
СН2ОНСОО- + Н+ + Н2О = 2СО2 + ЗН2	+19,3	3	-92,-331,-470

212

Окисление бутирата осуществляет Syntrophomonas wolfei. Гидрогеназа у этого организма расположена в периплазматичес-ком пространстве и ингибируется 2-8 мМ хлористой меди, которая воздействет только на периплазматический фермент. Для активации окисления ЛЖК за счет АТФ организмы вынуждены использовать обратный транспорт. Аналогично идет окисление пропионата у Syntrophobacter wolinii. Получая очень мало энергии, синтрофы растут медленно, и общая скорость осуществляемого ими процесса зависит от накопленной биомассы. Поэтому в сообществах наблюдается временное накопление ЛЖК. Синтрофные отношения не обязательно обусловлены деятельностью синтрофов "в строгом смысле^-, их функции могут выполнять и другие организмы.

При работе с анаэробными культурами, разлагающими малодоступные вещества, синтрофные отношения наблюдаются очень часто. Соответственно нередки и ошибки при описании "чистых культур", которые при проверке оказывались устойчивыми кооперативными комбинациями.

Для термодинамического разрешения роста за счет удаления Н₂ из сферы реакции важен тот нижний предел концентрации, до которого тот или иной организм способен удалять Н₂. Довольно быстро было установлено, что сульфатвосстанавливающие бактерии в этом отношении эффективнее метаногенов. Но для не зависящего от внешних акцепторов сообщества важны метаногены.. Специальные исследования были проведены с чистыми культура-, ми метаногенов на основе использования высокочувствительного твердоэлектролитного детектора Н₂ в Институте микробиологии РАН. Н₂ измеряли в газовой фазе, которая предположительно находится в равновесии с жидкой (по закону Генри концентрация растворенного газа находится в равновесии с газовой фазой пропорционально парциальному давлению). Оказалось, что водородные метаногены имеют определенные пороги, до которых они могут снижать содержание Н₂. Для мезофильных штаммов Ме-thanobacterium эта величина была около 5 р. р. т., а для Metha-nosarcina - около 50 р. р. т. Для термофильных штаммов Ме-thanobacterium пороговая величина была существенно выше, чем для мезофильных, и составляла 20-30 р. р. т. Психрофильных

213

водородных метаногенов пока в культурах нет. Существенно, что для метаногенного сообщества навоза - а оно представляет богатейший набор разных видов - пороговые концентрации точно соответствовали пороговым значениям для чистых культур водородных метаногенов. Повышение концентрации Н₂ было первым сигналом разбалансированности в работе сообщества вследствие какого-либо стресса. Впоследствии аналогичные работы были проведены и в других лабораториях. Определение нижнего порога концентрации Н₂ стало стандартным приемом и осуществляется очень просто - определяют конечную концентрацию Н₂ в поздней стационарной фазе роста культуры.

Как известно, выделение и потребление Н₂ осуществляется гидрогеназами, катализирующими обратимую реакцию:

Следовательно, можно предположить, что устанавливаются некоторые равновесные концентрации Н₂. Впервые такая равновесная концентрация была установлена Т. Н. Жилиной при разложении метанола Methanosarcina. При выделении чистой культуры метаногена упорным спутником ее оказался Desulfovibrio vulgaris, не использующий метанол, как и другие сульфатредукторы, но растущий с Н₂. Выяснилось, что метилотрофные мета-ногены при росте на метиламинах поддерживают стационарную концентрацию Н₂ за счет его выделения. Таким образом, в бинарной культуре Methanosarcina + Desulfovibrio метаноген выполнял роль синтрофа по отношению к сульфидогену, имеющему большее сродство к Н₂.

Синтрофные отношения исследуются в основном с помощью бинарных культур. Как правило, задача решается путем анализа с выделением чистых культур, за которым следует ресинтез - подтверждение реакции в комбинации двух чистых культур. Обычно комбинированные культуры дают только качественный ответ, количественное соответствие первоначальной накопительной культуре удается редко.

Сейчас известен ряд пороговых значений для разных групп вторичных Н₂-использующих литотрофных организмов. Они располагаются в следующем порядке:

214

Межвидовой перенос водорода подвел черту под эпохой исключительного господства чистых культур в бактериологии, юридически закрепленного Бактериологическим кодексом, по которому узаконивались только "чистые культуры в международно-признанных коллекциях". Этот перелом проходил в 1980-х гг. и до сих пор еще не вполне осознан представителями физиолого-биохимического направления и клеточной биологии. Для природоведческого направления общей микробиологии, наряду с чистой культурой, объектом исследования стало микробное сообщество.

Термодинамический выигрыш при удалении продукта реакции может быть получен не только для Н₂, но и для других соединений. Из них особенное внимание привлек формиат, который обладает высокой растворимостью и не переходит в газовую фазу. Формиат образуется в ряде смешанных брожений, особенно у энтеробактерий и клостридий. Он легко разлагается формиатлиазой по реакции:

Методы определения формиата менее чувствительны и удобны, чем для Н₂, и отчасти поэтому ясности здесь нет. Мнение, что формиат может быть объектом межвидового переноса, сомнению не подвергается, но значение этого процесса в природе оспаривается. Катаболическая синтрофия с межвидовым переносом водорода представляет один из ключевых процессов в анаэробном сообществе. Таким образом, водородный путь с участием гидрогенотрофных вторичных анаэробов в сочетании с явлением синтрофии оказывается принципиальным для сообщества в целом.

215