9. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

9.1. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СРЕД

Основу микробиологической техники, или know how, составляет приготовление сред, в которых способны развиваться культуры разных бактерий. Основная задача, которая преследуется при проектировании состава сред и условий культивирования, заключается в моделировании в лаборатории существенных параметров той экологической ниши, в которой организм развивается в естественных условиях обитания. Это работа, требующая и воображения, и понимания природной обстановки. При этом иногда небольшие различия в условиях культивирования позволяют выделять в чистую культуру и поддерживать бактерии. Для очень многих организмов, массовое развитие которых наблюдается в природе, условия культивирования еще не подобраны. Связано это, по-видимому, с динамической обстановкой, в которой организмы развиваются в природе, например, в условиях различных градиентов. Изменения, происходящие в химическом составе сред при культивировании, служат для описания химической функции организма.

Состав сред обусловлен следующими компонентами.

Минеральный фон. Наиболее простой подход к нему заключается в имитации 6-компонентного состава вод, в которых организм наблюдается, Катионный состав определяется, прежде всего, Na, Ca, Mg; анионный - хлоридом, сульфатом, бикарбонатом. Нужно обратить внимание на общую минерализацию среды, которая должна соответствовать тем водам, из которых организм предполагается извлечь в культуру. Для морских организмов лучше применять стерильную морскую воду, хотя бы на первом этапе. Для галофилов необходимо применять рассолы. Как правило, лабораторные среды чрезвычайно перегружены солями. На них нет надежды успешно культивировать обитателей пресных и тем более ультрапресных вод. Для пресных вод определенную возможность представляет карбонат кальция СаСО₃, с которым природные пресные воды находятся в равновесии, обеспечивая нейтральную реакцию. Правда, осадок мела часто неудобен в работе.

83

Минеральный фон определяет буферность среды. В лабораторной практике широко применяют 1/15-молярный фосфатный буфер. Для очень многих организмов фосфат оказывается селективным и даже угнетающим фактором. Прогресс в культивировании был достигнут с применением бикарбонатного буфера, предложенного Н. Пфеннигом (N. Pfennig). Однако бикарбонатный буфер находится в равновесии и с СO₂ воздуха, и с углекислотой, выделяемой или поглощаемой организмами во время роста, что зависит от температуры. Поэтому технически его не так просто использовать, и кислотность среды рН постоянно приходится контролировать. Тем не менее бикарбонатный буфер представляет естественную буферную систему природных вод и поэтому предпочтителен.

В некоторых условиях употребляют инертные органические буферы, которые хорошо держат рН и, по-видимому, безвредны для организмов.

Биогенные макроэлементы. Они включают биогены N, P, К, S, и их количество, вообще говоря, должно зависеть от предполагаемой плотности роста в стационарных культурах и может быть снижено до лимитирующих значений в проточных. Такие элементы как Na, Mg, Ca присутствуют в минеральном фоне, но за концентрацией магния приходится следить и вносить обычно в виде сульфата или хлорида. Концентрация калия мало изменяется во время роста. Обычно достаточно К, вносимого с фосфатами. Как уже упоминалось, концентрации фосфатов в лабораторных средах определяются не столько нуждами организма, сколько поддержанием рН. Для роста вполне достаточно 100 мг/л фосфата калия, чтобы культура находилась на плато даже при высоких плотностях. Специальную проблему составляют источники азота, по которым организмы резко различаются. Основных форм источников связанного азота три: соли аммония, нитраты, органический азот, который может быть либо в составе дрожжевого экстракта, либо в виде глутамата, глутамина, аспартата, аспарагина, мочевины. Для анаэробов лучше применять соли аммония, для аэробов - нитраты. Концентрация составляет первые сотни мг/л, хотя для массового культивирования употребляют 1-2 г/л сульфата или хлорида аммония. Источником серы обычно служат сульфаты, но для некоторых анаэробов критическим оказывается

84

применение сульфида в концентрации нескольких миллимолей/ литр (мМ). При повышении концентрации H₂S до 2 мМ может проявляться токсическое действие сероводорода.

Микроэлементы должны включать Fe, Co, Mo, Cu, Mn, Ni, иногда W, Se, V. Проблема с микроэлементами состоит в том, чтобы удержать их в растворе при данном рН. Обычно это достигается применением комплексообразователей - нитрилтриуксус-ной кислоты или ЭДТА (комплексона). Для железа, которого надо относительно много, применяют цитрат железа. Поддержание баланса доступного железа в среде обитания микроорганизмов представляет специальную проблему. Некоторые микроорганизмы, как уже говорилось, способны синтезировать специальные соединения сидерофоры, служащие для переноса железа в клетку. К ним относятся гидроксаматы, переносящие в клетку комплексы Fe³⁺. При восстановлении освобождается Fe²⁺ и переносчик. Эффективность этого процесса у бактерий столь высока, что они могут обусловить дефицит железа у других организмов, например, у своих хозяев. Перечисленные выше микроэлементы связаны с определенными функциями в клетке. Кобальт участвует в реакциях витамина В₁₂, молибден - в обмене азота, медь - в ряде окислительных ферментов, никель - в гидрогеназе и т.д. Отсутствие или недостаток этих микроэлементов в среде приводит к селективному росту других организмов.

Далее организмы могут нуждаться в органических веществах, которые в этом случае получают название факторов роста. К ним относятся чаще всего аминокислоты. Чтобы не разбираться на первом этапе в потребностях организма, применяют дрожжевой экстракт в такой концентрации, чтобы он не мог служить субстратом роста, т.е. 50-100 мг/л. При переходе к синтетической среде приходится проводить длительную работу, чаще всего по формуле "минус один", т.е. берут полную смесь, например 20 аминокислот, и смеси с отсутствием одной аминокислоты по очереди. Отсутствие роста указывает на необходимую аминокислоту. Трудность состоит в том, чтобы не внести минимальное необходимое количество ее с посевным материалом.

При тепловой стерилизации разрушаются многие витамины. Поэтому приходится вносить их отдельно из концентрированного

85

раствора, стерилизованного фильтрованием. Список витаминов и их функций следующий:

Субстраты катаболизма. Их выбор целиком определяется задачей исследования. Обычно они даются в концентрации граммов на литр, что многократно превышает концентрации, с которыми организмы встречаются в природе.

Типичный состав фоновой среды, применяемой для выделения свободноживущих пресноводных или почвенных бактерий, приведен ниже:

86

Поскольку состав среды оказывается в высокой степени специфичным для преимущественного роста тех или иных организмов, то существуют подробные "кухонные книги" состава сред. Такие сводки выпускают коллекции типовых культур. Обычно следует обращаться к первоначальной публикации, поскольку именно примененная автором среда оказалась селективной для данного вида. Селективность сред бывает очень высокой.

Следующую серию составляют условия культивирования, определяемые аэробными или анаэробными условиями, составом газовой фазы, температурой, освещенностью. В целом условия культивирования по химическим и физическим показателям составляют лабораторную имитацию, или моделирование, экологических ниш.

87